垂体腺瘤（pituitaryadenomas，PAs）发病率约为1/，其中一半以上是泌乳素瘤（prolactinomas）。典型临床症状为高泌乳素引起的神经内分泌症状，严重者可表现为头痛和视野缺陷等。且其中一部分泌乳素瘤具有高侵袭性和治疗抵抗性等特点，但其生物学机制尚不明确。
PAs大多属于良性肿瘤，具有较低的突变负荷。目前仅较少的驱动基因发现于其他亚型的PAs，比如促生长激素腺瘤的GNAS；促肾上腺皮质激素腺瘤的USP8等。然而，尚没有发现泌乳素瘤高频突变基因的报道，限制了对其致癌机制的了解及治疗策略的发展。
张亚卓教授致力于垂体腺瘤的临床治疗和基础研究，带领研究团队在开发和应用现代神经内镜技术治疗垂体腺瘤，并在国内普及推广。在临床诊疗与研究的基础上，针对垂体腺瘤的分子分类与个性化治疗进行了系统的研究。年5月19日，张教授团队在NatureCommunications刊发了垂体泌乳素瘤高频突变致癌机制的最新研究成果“SomaticSF3B1hotspotmutationinprolactinomas”。本文首次揭示了高频体细胞SF3B1突变在垂体泌乳素瘤中的致癌机制[1]。北京市神经外科研究所李储忠副主任医师、谢微嫣副研究员为并列第一作者；首都医科大学北京市神经外科研究所张亚卓教授、美国国立卫生研究院庄正平教授为共同通讯作者。诺禾致源癌症研究部承担测序、生信分析及数据挖掘等相关技术服务工作。
图1研究技术路线图
研究结果
01发现泌乳素瘤突变热点SF3B1RH
对发现队列共21个患者进行WGS测序。并使用诺禾致源针对良性瘤的分析流程进行了突变检测，共发现88个基因的90个突变，其中仅SF3B1RH发现于多于一个样本中（n=2）。随后在两个验证队列中，利用数字PCR进行验证。三个队列共样本，其中发生SF3B1RH突变的样本共45个，约占19.8%。
图2泌乳素瘤热点突变SF3B1RH
02SF3B1RH突变在泌乳素瘤中的作用
为了进一步验证SF3B1RH突变在泌乳素瘤中的致癌作用，本部分利用多种生物学试验验证其功能，包括培养野生型和突变型原代垂体瘤细胞，分别检测泌乳素（PRL）分泌水平；GH3和MMQ正常大鼠垂体细胞系，分别转染野生型和突变型SF3B1基因的腺（慢）病*载体，进行CCK-8试验和流式细胞试验。总结SF3B1RRH突变共有3个生物学作用：①促进PRL分泌，②促进细胞扩增，③抑制细胞凋亡。
图3SF3B1RH突变的下游效应
03SF3B1RH突变诱导ESRRG可变剪接
考虑到SF3B1是U2RNP剪接复合体的重要组分，推测其突变可能会影响可变剪接。因此我们选取2例SF3B1RRH突变样本，13野生型SF3B1样本，和10正常垂体进行RNA-seq，可变剪接分析发现SF3B1RRH突变样本具有不同的PSI（percentsplicedin）模式。
图4ESRRG异常可变剪接
SF3B1RRH突变组ESRRG表达量显著提高，且在转录本水平分析发现主要原因是转录本NM_.1（异常ESRRG）表达升高，RT-PCR验证发现此转录本仅存在于突变组。并利用体外转染模拟实验证实上述发现。
通过本实验及先前的研究发现SF3B1的剪接模体，分析发现ESRRG中含有最多的SF3B1剪接模体。随后经过Sanger测序证实：异常ESRRG在第5个外显子前增加了21nt核苷酸（属于A3SS）。并利用体外报告系统证实上述机制。
图5微基因可变剪接报告系统分析
04SF3B1可直接与ESRRGmRNA作用
为了进一步验证SF3B1突变是导致ESRRG转录本异常的直接原因，本部分利用RIP和CLIP-PCR技术，证实SF3B1能够直接与ESRRGmRNA作用；且SF3B1RH突变改变了其与ESRRGmRNA作用位点，与P8位置（异常ERSSG转录本特有）亲和力显著提高。
图6SF3B1RH改变与ESRRGmRNA的结合位点
05异常ESRRG增强了Pit-1的亲和力
Pit-1在垂体表达泌乳素（PRL）中发挥了重要作用。免疫沉淀实验证明ESRRG与Pit-1直接相互作用。为了进一步探讨异常ESRRG与Pit-1的亲和力，利用CO-IP实验发现异常ESRRG蛋白结合Pit-1的能力更强。并且利用体外荧光素报告系统证实：异常ESRRG增强与Pit-1亲和力，形成的复合体可识别PRL启动子，进而促进PRL表达。
图7异常ESRRG增强其与Pit-1亲和力
06异常ESRRG的致癌作用
为了验证异常ESRRG在泌乳素瘤中的致癌作用，选用多种生物学试验进行验证，包括培养野生型和突变型的原代垂体瘤细胞，分别检测PRL分泌水平；GH3和MMQ正常大鼠垂体细胞系，分别转染正常和异常ESRRG基因的腺病*载体，进行CCK-8试验和流式细胞试验。揭示由SF3B1RH引起的异常ESRRG导致PRL分泌增加，异常ESRRG具有促进细胞扩增及抑制细胞凋亡作用。
图8异常ESRRG的致癌作用
07SF3B1RH突变的临床关联
上述实验已经充分阐明SF3B1RH突变的致癌机制。为了进一步分析SF3B1RH突变的患者的临床特点，与临床数据关联发现：1.男性SF3B1RH突变患者占比较高；2.突变患者具有较高的血清PRL；3.突变患者具有较差的预后。图9SF3B1RH突变的临床关联
研究结论
利用WGS及数字PCR技术发现并验证泌乳素瘤的突变热点SF3B1RH。详实的体外实验证实:SF3B1RH突变导致ESRRG异常可变剪接，异常ESRRG增强了其与Pit-1蛋白的亲和力，形成的复合体能够与PRL上游增强子结合，促进PRL的表达，进一步促进细胞扩增。
图10SF3B1RH突变的致瘤机制
参考文献：
1.LiC,XieW,RosenblumJS,etal.SomaticSF3B1hotspotmutationinprolactinomas.NatCommun;11:.
癌症业务线郭延青
文案
单晴晴丨编辑
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